實時熒光定量PCR系統(tǒng)的軟件特點:
●反應板設置指南軟件使實驗設計非常簡單,包括復雜的多色熒光實驗;
●可選擇快速、標準或者9600反應模式;
●實時監(jiān)測擴增曲線;
●實驗過程中可以增加PCR循環(huán)數(shù);
●自動設置熒光基線,自動計算熒光閾值使數(shù)據(jù)分析大大簡化;
●可在同一反應板采用多種標準曲線對靶基因進行定量,可以簡化工作流程以及下游產(chǎn)物分析;
●基因表達相對定量軟件提供強大的結果分析顯示,可以自動將多達10塊96孔板基因表達實驗數(shù)據(jù)同時分析,并自動去除無關項數(shù)據(jù);
●自動SNP分析軟件可以簡單直觀的圖表輸出分型結果并自動進行分型質(zhì)量評分;
●解離曲線數(shù)據(jù)采集操作簡單,觀察方便,可以在儀器運行時觀察解離曲線數(shù)據(jù);
●觀察實時擴增曲線時可以非常方便的標定所對應的樣品孔位置;
●光源使用時間監(jiān)測及儀器系統(tǒng)自我診斷程序。
實時熒光定量PCR系統(tǒng)的反應體系和條件:
(1)模板濃度與純度:模板的初始濃度越低,結果的重復性越差。初始濃度越高,超出了反應體系的線性范圍,則需要對模板進行稀釋,否則隨著底物的過早耗盡,可能出現(xiàn)假陰性結果。如果待測模板的濃度處于PCR反應體系的較低檢出限附近。則需要檢測雙份以結果的可靠性。
(2)酶及其濃度:TaqDNA聚合酶有兩種,一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶:另一種是從大腸埃希菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應需要2。5U的酶。濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
?。?)Mg2+的濃度:Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)物有顯著影響。Mg2+的濃度過高,會增加引物二聚體的形成;Mg2+的濃度過低,會降低TaqDNA聚合酶的活性。